人胰腺癌中miRNAs的差异表达及部分功能研究
人胰腺癌中miRNAs的差异表达及部分功能研究
陈杰,  于双妮,  马怡辉,  赵武干,  卢朝辉
中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院病理科

 

microRNAs(miRNAs)是由21-25个核苷酸组成的非编码RNA,它通过与靶基因的3'-UTR的配对,促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达。胰腺癌是临床上治疗困难的疾病,对人类的健康威胁极大,大量研究工作集中于胰腺癌的肿瘤编码基因的筛查和功能的鉴定,关于miRNAs与此疾病的关系知之甚少,研究miRNAs在胰腺癌发病机制中的作用具有重要的意义。
本实验以用miRNAs芯片筛查胰腺癌组织与正常胰腺组织中差异表达的miRNAs。其中上调的有18个,下调的有14个。Northern Blotting实验验证了部分的芯片结果。K-RAS改变是胰腺癌中最典型的特征,并且是导致胰腺癌肿瘤恶性行为的一个关键因素,我们检测了胰腺癌细胞系中K-RAS蛋白水平,有些miRNAs的靶基因可能为K-ras.通过生物信息学验证,我们选定了几个miRNA 进行了功能研究,得到一些有意义的结果。
miR-96的研究:我们首先检测了胰腺癌细胞系以及正常胰腺组织中miR-96的表达水平,发现其在正常胰腺组织比胰腺癌细胞系中的表达下降。用质粒为载体在Mia PaCa-2细胞中高表达miR-96,结果发现K-RAS的mRNA水平不变、而蛋白水平下降,肿瘤细胞的恶性生物学行为(增殖、克隆形成能力、迁移和侵袭能力)受到了明显的抑制,同时肿瘤细胞凋亡增强;我们又检测了RAS下游通路中的两个重要分子ERK和AKT的表达有显著下降,它们的活化形式phospho-ERK和phospho-AKT也有不同程度的下降。生物信息学分析miR-96的前体序列发现,各物种间存在多个位点核苷酸的多态性,且位于前体的茎环结构区,但是成熟体的序列十分保守(>99%序列相同),小鼠的miR-96成熟体序列与人的序列完全一致,因此推测miR-96可能是进化过程中保留下来的具有肿瘤抑制功能的重要分子。过表达miR-96能在细胞水平上抑制肿瘤的恶性生物学行为, miR-96的表达下降是胰腺癌的肿瘤恶性行为发展的一个因素,是阐明胰腺癌肿瘤分子机制的一个重要补充。
mir-217的研究:我们前期的miRNA芯片发现,胰腺导管腺癌中hsa-mir-217表达显著下调,分析其可能在胰腺癌发生发展过程中发挥作用,但结果不清。本研究以人胰腺导管腺癌组织及细胞系为研究材料,检测hsa-mir-217的表达并探讨其功能及靶基因,旨在为胰腺导管腺癌的治疗寻找新的靶点。采用锁定核酸原位杂交及realtime RT-PCR的方法对胰腺导管腺癌组织及细胞系中hsa-mir-217表达进行检测,发现在64.3% (9/14)癌组织及所有7例细胞系中hsa-mir-217的表达都显著下调;采用构建的hsa-mir-217表达载体、合成的pre-mir-217前体和anti-mir-217抑制剂进行细胞转染,发现hsa-mir-217体外可抑制胰腺导管腺癌细胞PANC-1及MIA PaCa-2的增殖及非锚着依赖性生长,体内可抑制PANC-1移植瘤的生长, hsa-mir-217体内外均发挥抑癌基因的作用;用生物信息学软件对hsa-mir-217的靶基因预测及进一步验证发现:7种胰腺癌细胞系中hsa-mir-217表达与KRAS蛋白表达呈负相关;同时在PANC-1及MIA PaCa-2中恢复hsa-mir-217的表达可抑制KRAS蛋白表达及下游p-AKT活性,而在MIA PaCa-2中降低hsa-mir-217的水平则升高KRAS蛋白的表达及细胞的非锚着依赖性生长能力;报告基因实验进一步证实KRAS是hsa-mir-217的直接靶基因。这些结果提供了一种潜在的以miRNA为基础的胰腺癌治疗方法。
 
miR-27a的研究:我们前期的miRNA芯片发现胰腺癌中miR-27a存在上调,
近年来的研究发现,miR-27a在多种类型恶性肿瘤中表达上调,被认为具有癌基因功能。但是其在胰腺癌中的功能尚不清楚。本研究旨在探讨认识miR-27a在胰腺癌细胞中的作用及可能机制。
我们应用能够特异性抑制miR-27a活性的microRNA inhibitor,抑制胰腺癌细胞中内源性miR-27a功能,观察抑制后胰腺癌细胞生物学行为的改变;应用microRNAs靶基因预测软件和双荧光素酶报告基因实验筛选鉴定miR-27a的功能靶基因;应用免疫组织化学和western blotting的方法初步探讨miR-27a调控胰腺癌细胞恶性生物学特性的可能机制。
结果表明:抑制miR-27a能够降低胰腺癌细胞PANC-1和MIA PaCa-2的生长、克隆形成以及运动迁移能力;Spry2基因的3’UTR携带有miR-27a直接结合位点,并且胰腺癌细胞中Spry2蛋白的表达水平受miR-27a调控;抑制miR-27a能够下调胰腺癌细胞中p-Erk1/2的水平。 我们的研究结论如下:MiR-27a通过影响生长、克隆形成以及迁移运动能力在胰腺癌细胞的恶性表型中发挥癌基因功能;Spry2在胰腺癌中低表达,miR-27a可能通过影响Spry2蛋白,异常调控了胰腺癌细胞中的Ras/MAPK信号通路。
 

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